3图2表的双样本12+！首都医科大学王仁喜教授团队探究IL-6信号与肺动脉高压的因果关系
今天分享一篇来自首都医科大学团队的双样本MR，暴露是IL-6极其受体（6个IL-6信号基因和34个sIL-6R受体基因），结局是肺动脉高压。炎症，尤其是白细胞介素-6（IL-6），已被认为是肺动脉高压发病的关键因素。因此，经典的IL-6信号传导可能是PAH颇具前景的治疗靶点。这是这篇文章能发高分的核心原因。我们完全可以进行模仿思路，换个炎症因子或者换个疾病。
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文章题目：Mendelian randomization study on causal association of IL-6 signaling with pulmonary arterial hypertension
DOI： 10.1080/10641963.2023.2183963
中文标题：基于孟德尔随机化探究IL-6信号与肺动脉高压的因果关系
发表杂志：Clin Exp Hypertens
影响因子：12.3
发表时间：2023年12月
论文亮点
本研究采用Mendelian随机化方法，重新评估了IL-6信号通路与肺动脉高压（PAH）之间的遗传因果关联。研究使用了两组遗传工具变量（IVs），包括六个独立的IL-6信号通路和34个独立的可溶性IL-6受体（sIL-6R）遗传IVs，以及包含162,962名欧洲个体的PAH全基因组关联研究（GWAS）数据。结果显示，随着IL-6信号遗传水平的增加，PAH风险降低；而随着sIL-6R遗传水平的增加，PAH风险升高。研究结果表明，遗传上增加的sIL-6R水平可能是PAH的一个风险因素，而增加的IL-6信号可能是PAH的一个保护因素。这项研究的优势在于使用了大规模的GWAS数据和多种MR分析方法，提高了统计功效，为PAH的病理机制和潜在治疗靶点提供了新的见解。然而，研究的局限性在于样本限制在欧洲血统人群，且需要进一步的随机对照试验来验证IL-6信号通路或sIL-6R作为治疗靶点的有效性。
摘要
背景： 最近的孟德尔随机化 （MR） 不支持先导白细胞介素 6 受体 （IL-6 R） 变体对肺动脉高压 （PAH） 风险的影响。因此，我们使用两组遗传工具变异 （IV） 和公开可用的 PAH 全基因组关联研究 （GWAS） 来重新评估 IL-6 信号转导和 PAH 之间的遗传因果关系。
方法： 使用来自最近 MR 报告和 PAH GWAS 的 6 个独立 IL-6 信号转导和 34 个独立的可溶性 IL-6 受体 （sIL-6 R） 遗传 IV，包括 162,962 名欧洲个体进行这项双样本 MR 研究。
结果： 我们发现，随着IL-6信号转导的遗传增加，使用IVW可降低PAH的风险（比值比[OR]=0.023,95%置信区间[CI]：0.0013-0.393; p = .0093）和加权中位数（OR = 0.033,95% CI：0.0024–0.467; p = .0116）。否则，随着 sIL-6 R 的遗传增加，使用 IVW 时 PAH 的风险增加 （OR = 1.34,95% CI：1.16–1.56; p = .0001）、加权中位数（OR = 1.36,95% CI：1.10–1.68; p = .005）、MR-Egger（OR = 1.43,95% CI：1.05–1.94; p = .03）和加权模式（OR = 1.35，OR的95%CI：1.12–1.63; p = .0035）。
结论：我们的分析表明，遗传性增加的 sIL-6 R 与 PAH 风险增加之间以及遗传性增加的 IL-6 信号转导与 PAH 风险降低之间存在因果关系。因此，较高的 sIL-6 R 水平可能是 PAH 患者的危险因素，而较高的 IL-6 信号转导可能是 PAH 患者的保护因素。
关键词：L-6;sIL-6R;多环芳烃;全基因组关联研究;孟德尔随机化
介绍
肺动脉高压 （PAH） 是一种复杂的疾病，其特征是远端肺动脉循环进行性闭塞性血管病变 （1）。如果不治疗，PAH 会导致肺血管阻力、右心衰竭和死亡的进行性增加 （2）。PAH患者的发病率和死亡率显著升高（3）。尽管在过去 15 年中，有多种药物干扰内皮素、一氧化氮和前列环素通路，但 PAH 仍然是一种严重的临床疾病。
两项荟萃分析研究了精神分裂症与卒中之间的关联。2013 年进行的第一次荟萃分析确定了 7 项队列研究，并报告了中风发生的风险增加（合并风险比，1.95 [95% CI，1.41-2.70]）。
血管周围炎症是 PAH 患者和动物模型中突出的病理特征 （5）。炎症已被强调为 PAH 发展的关键因素，尤其是白细胞介素-6 （IL-6） （6）。因此，经典的 IL-6 信号转导可能是 PAH 的一个有前途的治疗靶标 （7）。孤立的病例报告提示，托珠单抗（一种靶向 IL-6 受体的单克隆抗体）可使 PAH 消退，治疗相关的系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病和 Castleman 病 （8,9）。然而，一项概念验证开放标签临床试验显示，托珠单抗对流行的 1 组 PAH 没有显著影响 （10）。该试验中缺乏疗效似乎与临床前细胞和动物模型中关于IL-6的重要潜在因果作用的广泛数据相矛盾 （1,5,7,10,11）。
许多因素，包括反向因果关系和混杂偏倚观察性研究，导致缺乏高质量的随机对照试验。 基于遗传变异在减数分裂时随机分配的原则，孟德尔随机化 （MR） 研究独立于许多偏倚观察性研究的因素，并已广泛用于确定暴露与结果之间的因果关系 （12–18).然而，最近的孟德尔随机化 （MR） 不支持 IL-6 使用 IL6R、rs7529229 和 PAH 全基因组关联研究 （GWAS） 中的遗传变异对 PAH 风险的影响，包括 11,744 名欧洲个体 （10）。因此，我们使用了两组遗传工具变异 （IV），包括 6 个独立的 IL-6 信号转导和 34 个独立的可溶性 IL-6 受体 （sIL-6 R） 遗传 IV，这些 IV 来自最近的 MR 报告和公开可用的 PAH GWAS，包括 162,962 名欧洲个体，以确定 IL-6 信号转导与 PAH 之间的遗传因果关系。
材料与方法
伦理批准和参与同意
本研究获得首都医科大学北京脑疾病研究所伦理委员会批准。本文包含由几个人收集的人类参与者先前的研究报告了大规模的GWAS。所有参与者在所有相应的原始研究中都给予了知情同意，如方法中所述。
IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传工具变异 （IV）
根据最近的 MR 报告 （19–22），选择了 IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传 IV。IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传 IV 已被用于确定 IL-6 与自身免疫性关节炎 （19）、缺血性卒中和其他心血管结局 （22）、抑郁症状 （21）、心血管疾病、免疫相关疾病和长寿 （20） 之间的因果关系。分别对 204,402 名欧洲个体 （23） 和血浆蛋白质组 GWAS 分别对 204,402 名欧洲个体 （23） 和血浆蛋白质组 GWAS 进行荟萃分析，产生了 6 个 IL-6 信号转导和 34 个 sIL6R 遗传 IV。“IL6 信号转导”是指 IL-6 R 遗传仪器，按 CRP 水平加权 （21） 和血浆 sIL6R 与 sgp130 形成抑制性受体以抑制 IL-6 信号转导 （25）。使用连锁不平衡 （LD） 矩阵工具确定 SNP 的 LD 水平 （https://ldlink.nci.nih.gov/?tab= ldmatrix， CEU; r2 < 0.1）。六种潜在的IL-6信号转导遗传IV 和 34 个潜在的 sIL-6 R 遗传 IV 如表 1 所示。
肺动脉高压 （PAH） GWAS
迄今为止，最大的PAH GWAS汇总统计是由2021年ieu开放GWAS项目提供的。该 PAH GWAS 由 125 例 PAH 病例和 162,837 例来自欧洲血统的健康对照组成。肺动脉高压（PAH）GWAS的汇总统计数据可在 https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finnbI9_HYPTENSPUL的ieu开放GWAS项目上获得 。表2显示了最大PAH GWAS的摘要信息。
肺动脉高压 （PAH） GWAS 中 IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传工具变异 （IV） 的关联
当 IL-6 信号转导和 sIL-6 R IV 在 PAH 汇总统计数据中找不到时，使用 LD 代理工具识别潜在的代理 SNP （r2 > 0.8）。所有 6 个独立的 IL-6 信号转导遗传 IV 均依次从该 PAH GWAS 汇总统计数据中提取。34 个独立的 sIL-6 R遗传IVs，从该PAH GWAS汇总统计中依次提取33个。PAH GWAS数据集中IL-6信号转导和sIL-6 R遗传IV的关联如表3所示。
多效性试验
MR-Egger 截距和 MR-多效性残差和异常值 （MR-PRESSO） 检验之前已被描述用于测试多效性 （26）。MR-Egger 基于具有逆方差加权 （IVW） 的相同回归模型，但允许并使用 MR-Egger 截距检验 （26–28） 来解释潜在的多效性。如果所选的遗传变异不是多效性的，则随着样本量的增加，MR-Egger 截距项应趋于零 （28）。MR-PRESSO可以通过异常值去除（MR-PRESSO异常值检验）来检测和校正水平多效性（26）。R 包“孟德尔随机化”（29）和“MR-PRESSO”（26）用于完成统计检验。采用MR-Egger截距和MR-PRESSO方法测试PAH GWAS数据集中独立IL-6信号转导或sIL-6 R遗传IVs的多效性。多效性试验结果见表4。 p > .05 表示 PAH 中独立 IL-6 信号转导或 sIL-6 R 遗传 IV 的多效性。
异质性检验
Cochran’s Q 统计量中的 MR-Egger 和逆方差加权 （IVW） 已被广泛用于检查异质性 （30,31）。Cochran 的 Q 统计量可以提供由于多效性或其他原因导致的异质性的证据 （30）。R 包“孟德尔随机化”（29）用于完成统计检验。采用Cochran’s Q统计量中的MR-Egger和逆方差加权（IVW）来检验PAH GWAS数据集中独立IL-6信号转导或sIL-6 R遗传IVs的异质性。异质性检验结果如表4所示。 Q_p val > 0.05 表示 PAH GWAS 中独立 IL-6 信号转导或 sIL-6 R 遗传 IV 没有异质性。
MR分析
选择 IVW 作为主要的 MR 分析方法，通过将变异特异性 Wald 估计量的近似方差的倒数作为相应的权重来组合变异特异性 Wald 估计量 （28）。此外，我们还选择了加权中位数，该中位数可以产生一致的估计值，即使多达 50% 的选定遗传变异无效 （26–28）。R 包“孟德尔随机化”（29） 用于完成 MR 分析中的所有统计检验。采用MR-Egger、加权中位数、IVW和加权模式等4种MR分析方法分析IL-6信号转导或sIL-6 R水平与PAH的因果关系。MR分析结果如表5所示。 p < .05 表示 IL-6 信号转导或 sIL-6 R 水平与 PAH 的因果关系。为了分析单个SNP效应，分析了IL-6信号转导或sIL-6 R相关SNP对PAH的个体因果效应和单效应大小，分别如图1和图2所示。
留一出效果分析
在IVW（随机效应）模型下，我们研究了外围和多效性SNP对采用遗漏策略的因果估计的潜在影响（32）。这种方法与敏感性分析方法一样，执行 MR 分析，但依次省略每个 SNP，以确定单个 SNP 是否驱动关联 （32）。IL-6 信号转导或 sIL-6 R 相关 SNP 对 PAH 的遗漏效应如图 3 所示。
结果
IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传器械变异 （IV） 在肺动脉高压 （PAH） GWAS 中没有显着的多效性或异质性
6 个独立的 IL-6 信号转导遗传 IV 和 34 个独立的 sIL-6 R 遗传变异被用作潜在的遗传 IV（表 1）。从PAH GWAS中成功提取了6个独立的IL-6信号转导遗传IV和33个独立的sIL-6 R遗传IV（表2）。六人协会PAH GWAS中的独立IL-6信号转导遗传IV和33个独立的sIL-6 R遗传IV如表3所示。在PAH GWAS数据集中，我们发现6个独立的IL-6信号转导遗传IV和33个独立的sIL-6 R遗传IV没有多效性或异质性（表4）。因此，在我们的 MR 研究中，所有选定的 IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传变异都可以作为有效的 IV。
IL-6 信号转导在遗传上降低肺动脉高压 （PAH） 风险
随着 IL-6 信号水平的遗传增加，使用 IVW 可降低 PAH 的风险（β = -3.79，β 的 95% CI：-6.653– -0.935;OR = 0.023，OR 的 95% CI：0.0013–0.393; p = .0093）和加权中位数（Beta = -3.41，β 的 95% CI：-6.051– -0.762;OR = 0.033，OR 的 95% CI：0.0024–0.467; p = .0116）（表 5）。对因果效应的个体 MR 估计表明，随着单个 SNP 对 IL-6 信号转导的影响增加，使用 IVW 和加权中位数，单个 SNP 对 PAH 的抑制作用增加（图 1A）。每个效应量分析表明，六个 IL-6 信号相关的 SNP 对 PAH 的每个影响都是相似的，并且没有导联 IV（图 2A）。MR 遗漏-1 的敏感性分析表明，去除 6 个 IL-6 信号相关 SNP 的特定 SNP 不会改变结果（图 3A）。总的来说，我们的数据表明，遗传性增加的IL-6信号水平与PAH风险降低之间存在因果关系。
sIL-6 R 在遗传上促进肺动脉高压 （PAH） 风险
随着 sIL-6 R 水平的遗传增加，使用 IVW 时 PAH 的风险增加（β = 0.29，β 的 95% CI：0.146– 0.444;OR = 1.343，OR 的 95% CI：1.1569–1.5588; p = .0001），加权中位数（Beta = 0.31，beta 的 95% CI：0.093–0.521;OR = 1.360，OR 的 95% CI：1.0975–1.6844; p = .0049）、MR-Egger（beta = 0.36，beta 的 95% CI：0.052–0.664;OR = 1.430，OR 的 95% CI：1.0538–1.9416; p = .0286）和加权模式（Beta = 0.30，beta 的 95% CI：0.114–0.488;OR = 1.351，OR 的 95% CI：1.1203–1.6293; p = .0035）（表 5）。对因果效应的个体 MR 估计表明，随着单个 SNP 对 sIL-6 R 水平的影响增加，使用 IVW、加权中位数、MR-Egger 和加权模式，单个 SNP 对 PAH 的促进作用增加（图 1B）。每个效应量分析表明，33 个 sIL-6 R 相关 SNP 对 PAH 的每个影响都是相似的，并且没有导联 IV（图 2B）。MR 遗漏 1 的敏感性分析表明，去除 33 个 sIL-6 R 信号相关 SNP 的特异性 SNP 不会改变结果（图 3B）。总的来说，我们的数据表明遗传性增加的 sIL-6 R 水平与 PAH 风险增加之间存在因果关系。
讨论
本 MR 研究证明了遗传性增加的 sIL-6 R 水平与 PAH 风险增加之间以及遗传性增加的 IL-6 信号转导与 PAH 风险降低之间的因果关系。因此，较高的 sIL-6 R 或较低的 IL-6 信号水平的遗传易感性可能在遗传上与较高的 PAH 风险相关，而较高的 IL-6 信号转导可能在遗传上与较低的 PAH 风险相关。我们的研究结果显示确凿证据表明，过度活跃的 IL-6 信号通路导致 PAH 风险降低，而其负调节因子 sIL-6 R 水平在遗传上增加了 PAH 的风险。
Toshner 等人最近使用 MR 研究发现，先导 IL-6 R 变体对 PAH 风险没有影响 （10）。他们使用了IL6R的遗传变异，rs7529229和总样本量（11,744）。低统计功效是 MR 研究的主要局限性 （33）。为了提高统计功效，我们使用了两组遗传工具变异（IVs），包括6个独立的IL-6信号转导和34个独立的sIL-6 R遗传IVs，以及迄今为止最大的PAH全基因组关联研究（GWAS），总样本量（162,962个欧洲个体）。由于统计学功效较高，我们发现遗传性增加的 sIL-6 R 水平与 PAH 风险增加以及遗传性增加的 IL-6 信号转导与 PAH 风险降低之间存在因果关系。
IL-6 R 还与 IL-6 结合（“反式信号转导”）以抑制 IL-6 的作用，例如 IL-6 诱导的炎症 （34）。 与对照组相比，PAH 患者的 sIL-6 R 浓度 [69.7 （IQR 60.4–84.4） vs 45.7 （IQR 34.6– 70.3） ng/ml， p = .0036] 增加 （35）。因此，IL-6 反式信号转导在 PAH 中增强 （35）。sIL-6 R 浓度升高表明其在 PAH 中 IL-6 信号转导的全身扩增中具有潜在的不利作用 （35）。IL-6 反式信号转导可导致慢性缺氧诱导的肺动脉高压 （36）。与这些研究一致，我们的研究表明遗传性增加的 sIL-6 R 水平与 PAH 风险增加之间存在因果关系。因此，sIL-6 R 可能是 PAH 的危险因素。
在 PAH 中，除了使用伊马替尼靶向增殖 （37） 外，在过去 20 年中，没有新的假设存活到药物开发的第 3 阶段 （38）。肺和血清 IL-6 的增加与 PAH 相关 （39）。许多研究表明，小鼠暴露于缺氧后，肺 IL-6 mRNA 水平迅速升高，在 24 小时达到峰值，并在一周内保持升高 （40,41）。这些研究强调了IL-6作为治疗PAH治疗靶点的重要性。孤立的病例报告表明，托珠单抗对 PAH 相关的系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病和卡斯尔曼病 （8,9）。然而，一项 2 期开放标签临床试验显示，托珠单抗对特发性或遗传性 PAH 以及与 CTD 相关的 PAH （不包括 SLE、RA 和混合性 CTD）没有显著影响 （10）。与这项 2 期开放标签临床试验一致，我们的分析研究也不支持 IL-6 信号转导可能是 PAH 的一个有前途的治疗靶点。
肺动脉平滑肌细胞 （PASMC） 中的 IL-6 浓度升高，但内皮细胞中未升高，这表明 PASMC 可能是 IL-6 升高的来源 （42）。IL-6 的局部血管和自分泌产生是否比炎症细胞更重要是一个悬而未决的问题，但 PASMC 的反复证明至少表明了一种机制，即局部 IL-6 信号转导可以与经典促炎细胞因子解偶联 （38）。IL-6 信号转导的经典通路通过膜结合的 IL-6 Rα （mIL-6 Rα） 介导 T 细胞驱动的免疫应答，而其反式信号转导仅在局部位点（即通过 sIL-6 Rα 在受累组织中）发挥作用 （43）。因此，局部 sIL-6 Rα 诱导血管周围炎症，这是大多数肺动脉高压 （PH） 动物模型以及肺动脉高压 （PAH） 患者中突出的病理特征 （5）。与这些研究一致，之前的一项研究指出，IL-6 在稳态中的作用是通过经典信号转导通路介导的，而病理相关反应是由 IL-6 反式信号转导介导的 （36,44）。当特异性抑制 IL-6 反式信号转导应仅阻断 IL-6 的促炎作用而不抑制其重要的稳态特性时，它可能具有临床意义 （36）。
IL-6 具有上下文依赖性抗炎特性 （44）。IL-6 可预防致命的肺部病变 （45）。IL-6 还诱导 IL-1 受体拮抗剂和肿瘤坏死因子的可溶性 p55 受体表达 （44,46）。这些发现与 IL-6 促进与伤口愈合相关的可变活化巨噬细胞表型的能力及其抑制巨噬细胞杀微生物活性和促炎细胞因子产生的能力一致 （44,47,48）。此外，IL-6 促进 T 细胞产生 IL-10，这会限制许多炎症过程 （49,50）。这些研究表明IL-6具有抗炎作用。与 IL-6 的抗炎作用一致，我们的研究表明遗传增加的 IL-6 信号转导与 PAH 风险降低之间存在因果关系。IL-6 通过 mIL-6 Rα 发出信号以诱导抗炎反应 （36）。因此，未来的研究需要考虑IL-6经典通路通过mIL-6 Rα及其通过IL-6 Rα的反式信号转导在PAH疾病过程中的复杂作用可能是值得的。
这项研究有几个优点。首先，从先前报道的 204,402 名欧洲个体 （23） 的大规模 IL-6 信号转导 GWAS 和 3,301 名欧洲个体的血浆蛋白质组 （sIL-6 R） GWAS （24） 中选择了 6 个独立的 IL-6 信号转导和 34 个独立的 sIL-6 R 遗传 IV，并在最近的 MR 报告中广泛使用 （19–22).其次，从PAH GWAS中依次提取了6个独立的IL-6信号转导和34个独立的sIL-6 R基因IV中的33个。第三，我们使用了四种不同的 MR 分析方法，证明 IL-6 信号转导和 sIL-6 R 遗传 IV 作为有效 IV 没有显着的多效性或异质性。第四，包括 IVW 和加权中位数在内的两种 MR 分析方法证明了遗传增加的 IL-6 信号转导与降低 PAH 风险之间的因果关系，包括 IVW、加权中位数、MR-Egger 和加权模式在内的四种 MR 分析证明了遗传增加的 sIL-6 R 水平与增加 PAH 风险之间的因果关系。第五，所有三种方法都表明IL-6信号转导和sIL-6 R SNPs对PAH的每种影响都没有明显的偏倚。最后，我们使用了 IL-6 信号水平及其负调节因子 sIL-6 R，关键是，它们显示出相反的结果。
这项研究有几个局限性。首先，我们的IL-6信号转导和sIL-6 R IVs和PAH GWAS数据集来自欧洲血统。因此，我们的结果需要在其他祖先中得到证明。其次，需要随机对照试验来阐明阻断IL-6信号转导或sIL-6 R是否对某些PAH亚群有效。第三，IL-6信号转导或sIL-6 R遗传影响PAH风险的潜在机制尚不清楚，值得未来探索。
总之，我们的结果表明，遗传性增加的 sIL-6 R 水平与 PAH 风险增加以及遗传性增加的 IL-6 信号转导与 PAH 风险降低之间存在因果关系。因此，较高的 sIL-6 R 水平可能是 PAH 患者的危险因素，而较高的 IL-6 信号转导可能是 PAH 患者的保护因素。
