最标准的蛋白组生信流程长这样🙏🏻
蛋白组学（Proteomics）
蛋白组学是研究细胞、组织或生物体内所有蛋白质的科学，特别是它们的结构、功能、相互作用和变化。
蛋白组学的核心是通过高通量技术，特别是质谱（Mass Spectrometry, MS）和其他生物技术，来分析和鉴定蛋白质。
它是基因组学的延伸，主要关注基因编码信息如何在蛋白质水平上体现，以及蛋白质如何与生物体的功能和健康状态相关。
蛋白组学实验的生物信息分析流程
1. 质谱数据预处理工具扩展与选择依据：
- MaxQuant：适用于Thermo质谱仪数据，支持高分辨率仪器（如Orbitrap）的定量分析，并内置Andromeda搜索引擎，能够高效处理复杂的质谱数据。
- Proteome Discoverer：作为Thermo官方工具，兼容性高，支持TMT/iTRAQ标记定量，适合临床和大规模研究中的蛋白定量分析。
- OpenMS：开源且灵活，适合定制化分析流程（如Knime/Python集成），能够满足复杂的数据处理需求。
补充技术细节：
- 格式转换：转换时需校验数据完整性，如检查总离子流图（TIC）是否一致，以确保数据不丢失或畸变。
- 去噪方法：可采用小波变换（如DtaRefinery）或机器学习去噪方法（如MS2深度学习模型）提高数据质量。
- 位素峰校正：考虑同位素丰度（如C13与N15标记）和电荷状态差异，进行峰校正以确保同位素标记样品的准确性。
- 保留时间校准：可使用内标肽段（如iRT Kit）或动态时间规整（DTW）算法调整样品间的保留时间差异。
2. 数据库搜索工具对比：
- MSFragger：支持开放式搜索，适合复杂样本的定性分析。
- X!Tandem：适用于高碎片离子容差的情况，特别适用于ETD/ECD碎裂数据。
- Comet：分析速度较高，适合大数据量的高效分析。
参数优化关键点：
- 酶切规则：设置半酶切允许（如Trypsin允许一个漏切位点），根据实验需求调整。
- 修饰参数：动态修饰（如磷酸化、氧化）一般限制≤4个；静态修饰（如Cys烷基化）需固定。
- 质量容差：高分辨率仪器一般设置为母离子±10 ppm，碎片±0.02 Da。
- FDR控制：使用Target-Decoy策略控制假阳性率，提高分析可靠性。
3. 定量分析标记与非标记定量对比：
| 类型 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|
| TMT/iTRAQ | 多重样本（11–16plex） | 同位素干扰需校正（如TMT校正因子） |
| Label-free | 无标记成本，适合临床大样本 | 批次效应敏感，需严格标准化 |
4. 差异分析策略：
- 统计方法：
- 小样本：t-test 或 Wilcoxon 检验
- 多组样本：ANOVA
- 样本与批次效应同时考虑：线性混合模型（如limma的voom函数）
- 多重检验校正：
使用 Benjamini-Hochberg 控制全局FDR，适合大规模数据分析；关键靶标筛选可使用 Bonferroni 方法。 - 可视化工具：
- 火山图（Volcano Plot）：展示差异倍数与p-value关系
- 热图：聚类分析，展示差异蛋白分布
5. 功能注释与通路分析
富集分析进阶策略：
- 背景库选择：使用实验鉴定蛋白作为背景库，避免通路富集偏倚。
- 层次富集：先进行GO Cellular Component富集筛选亚细胞定位，再进行Molecular Function分析，明确生物学作用。
- 网络富集工具：使用 Cytoscape 插件 ClueGO 整合多数据库结果，或用 GSEA 进一步分析富集通路。
蛋白互作网络：
- STRING数据库：设置信度阈值（≥0.7），导出TSV文件结合 Cytoscape 分析，揭示蛋白间的相互作用网络。
6. 高级分析
· 翻译后修饰（PTM）分析：
- 磷酸化位点定位：通过 PTMProphet 或 PhosphoRS 等工具对修饰位点进行概率评分，以精确定位磷酸化位点。
- 修饰动力学：针对时间序列数据，采用 Sigmoid 函数等曲线拟合方法，分析修饰位点的动态变化。
· 结构预测与功能关联：
- AlphaFold2：利用 AlphaFold2 对未解析结构的蛋白进行预测，并结合 PyMOL 分析蛋白的活性口袋或突变对功能的影响。
- 分子对接：通过 AutoDock Vina 进行蛋白-配体的分子对接预测，验证潜在药物靶点，探讨其相互作用机制。
7. 多组学整合：关联策略
· 共表达网络：
通过 WGCNA 构建蛋白与基因的共表达网络，揭示重要的功能模块。
· 通路映射：
利用 KEGG Mapper 将转录组与蛋白组数据中的差异分子进行映射，挖掘潜在的生物学通路。
· 机器学习：
利用随机森林或 PLS-DA 等方法筛选特征标志物，揭示潜在的生物学机制。
公共数据库分析流程
数据获取与预处理：
· 数据库选择逻辑：
- 原始数据：PRIDE Archive（欧洲）、PeptideAtlas（美国）是常用数据源，可根据政策和研究需求选择。
- 注释数据：UniProt 提供全面注释，neXtProt 更关注人类特异性蛋白。
· 批次效应校正：
- ComBat：通过指定批次变量校正技术重复数据的批次效应。
- SVA：处理未知混杂因素（如样本采集时间）以提高数据可比性。
· Meta分析关键点：
- 异质性检验：使用 Cochran’s Q 检验不同研究间的差异，确保分析可靠性。
- 效应量合并：依据异质性选择合适模型（如随机效应 DerSimonian-Laird 或固定效应模型）。
· 多组学关联示例：
- 转录-蛋白关联：通过计算 mRNA 与蛋白质的 Pearson 相关性，筛选一致性分子。
- 代谢-蛋白网络：构建 Reactome 超通路，定位关键代谢调控节点，揭示生物学重要交互。
常见问题与解决方案
- 低丰度蛋白漏检：可增加样本量或使用高灵敏质谱仪（如 timsTOF）结合 DIA 技术提升检测灵敏度。
- 修饰位点假阳性：结合保留时间对齐（如 Skyline）与 MS2 手动验证，减少假阳性结果。
